内源性NO对烧伤休克大鼠微循环的保护作用

　　关键词： 烧伤；休克；一氧化氮；微循环 生死游戏34yx.com

　　【摘要】　目的　探讨NO在烧伤休克发病中的作用及机制。方法　采用大鼠40%体表面积深Ⅱ度烫伤模型，观察NO合成酶抑制剂L-NAME和NO合成前体L-Arg对动物平均动脉压、肌肉微循环、血浆中NO^-₂/NO^-₃浓度和存活时间的影响。结果　烧伤后NO合成增多，同时平均动脉压下降，肌肉微循环紊乱；抑制NO生成可提升血压，但却加重微循环紊乱，加速动物死亡；促进NO合成则明显改善微循环，延长动物存活时间。结论　NO大量合成是机体在烧伤早期的一种保护性反应。

　　Protective role of endogenous nitric oxide to microcirculation of rats during burn shock　Shi Shengjun,Wu Kunying.Department of Pathophysiology,The First Military Medical University,Guangzhou,510515 illask.com

　　【Abstract】　Objective　To investigate the role of nitric oxide (NO) in burn shock.Methods　A model of 40% TBSA deep Ⅱ burn injury in rats was used.The effects of L-NAME,the inhibitor of NO synthase,and L-Arg,the precursor of NO synthesis,on the mean arterial pressure (MAP),microcirculation of muscle,concentration of NO^-₂/NO^-₃ in plasma and the survival time of animals were observed.Results　The results showed that the synthesis of nitric oxide was increased significantly,accompanied with the decrease of MAP and the disturbances of microcirculation of muscle after burn.L-NAME inhibited the decrease of MAP,but aggravated the disturbances of microcirculation and shortened the survival time of animals,while L-Arg produced the contrary effects.Conclusion　The results indicated that the large amount of NO in blood after burn may play an early protective role to injury.

　　【Key words】　Burn Shock Nitric oxide Microcirculation 我的健康my-health.cn

　　一氧化氮(NO)是近年来发现的一种新的信息分子，已知其与多种生理和病理状态的调节有密切关系^［1］。在失血及内毒素休克时，NO水平升高可导致血管反应性降低，而使用NO合成酶抑制剂却使病情加重^［2］。在烧伤休克研究中，有报道表明，大鼠烫伤后尿中NO的稳定终产物NO^-₂/NO^-₃的量明显升高^［3］，但NO在烧伤休克中的具体作用，尤其是对烧伤休克早期微循环影响的研究报道尚少。我们将L-Arg和L-NAME应用于烧伤大鼠，观察其对微循环各参数的影响，探讨NO在烧伤早期微循环障碍中的作用及机制。

　　1　材料与方法 34yx.com

　　1.1　动物处理

　　SD大鼠32只，体重180～220克，雌雄不拘，随机分为4组：烧伤+生理盐水组(对照组)，烧伤+L-Arg组(100mg/kg,L-Arg组)，烧伤+L-NAME组(5mg/kg,L-NAME组)，烧伤+L-Arg(100mg/kg)+L-NAME组(5mg/kg,联合组),每组8只动物。于实验前12小时动物禁食，自由饮水。腹腔注射13.3%乌拉坦+0.5%氯醛糖麻醉(0.6ml/100g)，一侧颈动脉插管，接三通管用于监测血压、抽血及给药。待动物状态稳定后记录血压，抽血0.6ml，离心取上清液备用，回输0.6ml生理盐水(对照组)或等体积的L-Arg、L-NAME溶液，迅速将动物髂前上棘以下部分浸入80℃水中30秒，造成全身40%面积的深Ⅱ度烫伤^［4］。 生死游戏34yx.com

　　1.2　微循环观察

　　在自制的大鼠微循环观察台上按照Gray法^［5］制作大鼠左侧脊斜肌活体微循环观察标本，用Krebs液恒温滴注，用Olympus显微镜和显微摄像录相装置以及Model 102红细胞跟踪仪、ForⅣ-550电视测微仪等设备观察脊斜肌第三级动、静脉的口径和流速及每100μm细静脉壁上的白细胞粘附数，利用公式计算细静脉流量：流量=流速×口径²×π/6.4。每小时监测一次血压，并分别于烧伤后第1，3，5小时各抽血0.6ml，回输0.6ml生理盐水。观察5小时后取下标本，湿纱布覆盖背部创口，对动物进行保暖，观察存活时间。 34yx.com

　　1.3　血浆NO^-₂/NO^-₃含量测定^［6］

　　血浆加1/20体积的30%硫酸锌溶液，离心取上清液，经过由蒸馏水、0.1mol/L盐酸、蒸馏水、5%氢氧化胺溶液各5ml处理过的铜-镉还原柱(150mm×8mm)，以0.05%氯化铵(pH=9.0)为洗脱液，收集过柱后的液体2.5ml，加Griess试剂1ml，用紫外分光光度计在λ540nm处比色，以倍比稀释的硝酸钠溶液经同样步骤后的检测结果绘制标准曲线，以此为据确定NO^-₂/NO^-₃的含量。 healthhot.cn

　　1.4　统计学处理

　　所有实验数据均用均数±标准差(±s)表示，统计方法采用方差分析。统计软件由本校计算机教研室提供。 益康在线Go36.com

　　2　结果

　　2.1　一般状况 34yx.com

　　正常大鼠平均动脉压(MAP)为15.0±1.1kPa(1kPa=7.5mmHg)，在烧伤后1小时略有上升，此后血压进行性下降，如无治疗措施，一般于伤后7～8小时死亡。用L-NAME后，大鼠MAP明显升高，在烧伤后第2小时为22.2±1.8kPa，与对照组比较P＜0.001；但该组动物于烧伤3小时MAP开始急剧下降，大多数动物(7/8)于烧伤后5小时内死亡。给L-Arg后对MAP的影响没有L-NAME显著，但该组动物的存活时间显著延长，所有动物存活时间均超过5小时，近半数动物(3/8)存活时间超过12小时。联合用药组则与对照组无明显差异(图1)。

^*P＜0.05，^**P＜0.01，与对照组比较 益 康 在 线

　　图1　各组烧伤休克大鼠平均动脉压的变化

　　Fig1　Changes of MAP in rats after burn in each group 生死游戏34yx.com

　　2.2　血浆NO^-₂/NO^-₃含量变化

　　正常大鼠血浆NO^-₂/NO^-₃的含量为26.6±3.4μmol/L，伤后血中NO^-₂/NO^-₃水平显著升高，比伤前增多一倍以上，L-NAME能完全抑制这种改变。L-Arg和L-NAME联用在早期可以解除L-NAME对NO^-₂/NO^-₃增高的抑制作用，到第4，5小时以后，血中NO^-₂/NO^-₃的水平又远低于对照组(表1)。 生死游戏34yx.com

　　2.3　微循环改变

　　2.3.1　细静脉流量的变化 Go36.com

　　细静脉流量反映组织的实际灌流情况。对照组大鼠烧伤后的细静脉流量进行性下降，从第1小时的526.1±76.5pl/s降到第4小时的127.4±97.3pl/s，L-NAME使组织灌流量的下降加快(与对照组比较，第1，3小时，P＜0.05)，而L-Arg明显减缓组织灌流量的下降速度，在烧伤后的各个时间点灌流量均高于对照组(P＜0.01)，微循环得到明显改善(图2)。

表1　大鼠烧伤后血浆中NO^-₂/NO^-₃浓度的变化(μmol/L) illask.com

　　Tab1　Changes of concentrations of NO^-₂/NO^-₃ in plasma of rats pre and post burn (μmol/L)

　　与对照组比较　^*P＜0.05，^**P＜0.01

与对照组相比较：^**P＜0.01 illask.com

　　图2　烧伤后1，3小时各组大鼠细静脉流量的变化

　　Fig2　Changes in blood volume of venule in rats on 1h and 3h after burn 我的健康my-health.cn

　　2.3.2　白细胞附壁数

　　白细胞附壁数以每100μm长的细静脉(口径在30～40μm之间)壁上10秒钟内没有移动的白细胞数目来计算。正常大鼠细静脉中偶有附壁的白细胞(5个/100μm以下)，但很快就被血流冲走，烧伤后白细胞附壁数逐渐增多，L-NAME组动物的白细胞附壁数明显高于其余各组(第1，2，3小时，P＜0.01)。而L-Arg组的白细胞附壁数却明显低于对照组(各时间点P值均小于0.01)，联合用药组动物的白细胞附壁数仅在第1小时与对照组比较有明显的不同(表2)。 益康在线Go36.com

　　2.3.3　细动脉口径及流速变化

　　烧伤后细动脉口径逐渐缩小，但各组之间差异不大，只有L-NAME组口径缩窄比较明显。对照组细动脉流速在烧伤后从1.41±0.23mm/s降至0.23±0.12mm/s(P＜0.01)。用L-NAME可明显加快细动脉流速的下降速度(烧伤后1，2，3小时，P＜0.01)，L-Arg则明显减慢这种趋势(伤后1，2，3小时，P＜0.01)，联合用药组与对照组无明显差异(表3)。 益 康 在 线

　　3　讨论

　　NO是一种半衰期很短的信使分子，它在神经传导、调节血管张力和免疫杀伤方面都有较强的作用^［1］。本实验结果表明，烧伤后大鼠血中NO终产物NO^-₂/NO^-₃的含量明显增加，血压呈缓慢的进行性下降，这与以前的有关报道是一致的^［3］。给NOS抑制剂可以阻止动物血液中NO^-₂/NO^-₃含量的上升，并能明显提升动物的血压，提示烧伤休克时血压降低与NO的生成增多有一定关系，但L-NAME在升高动物血压的同时，却使肌肉微循环的细静脉、细动脉流速减慢，流量下降，白细胞附壁数增多，动物存活时间缩短。应用L-Arg后，动物血压改变不明显，但确能明显改善微循环，细静脉内白细胞附壁程度明显减轻，血流速度加快，血流量增加，较大地提高了动物的存活率。联合用药组动物多数指标与对照组无显著差异，仅在伤后5小时血中NO^-₂/NO^-₃浓度下降，白细胞附壁数目增多，提示L-Arg比L-NAME的代谢速度要快。 illask.com

　　这些结果表明，血液中NO含量增加很可能是机体在烧伤休克早期的一种保护性反应。NO可扩张局部血管，降低组织缺血、缺氧程度，同时还可使微血管通透性降低，减少血浆渗出，因而维持了血容量不至于明显减少。另外，NO是白细胞和血小板粘附于血管内皮的内源性抑制剂，局部NO生成增多可以减轻白细胞、血小板的聚集及粘附程度，从而减轻对内皮细胞的损伤，抑制白细胞激活，减少氧自由基、溶酶体酶等杀伤因子的释放，减轻组织损伤。因为NO具有较强的扩血管作用，人为抑制NO的产生，可以显著提升血压，但这是以减少微循环血流为代价的，它使烧伤区域乃至整个外周血管收缩，血流减慢，加重创面损伤，更会使器官血流量下降，加重病情，促进死亡。事实上，在研究较为深入的内毒素性休克和失血性休克模型中，已有很多学者证实，NOS抑制剂的应用加速病情恶化，对预后非常不利^［2，7］。

表2　烧伤休克大鼠白细胞粘附数的变化(个/100μm细静脉) 益康在线Go36.com

　　Tab2　Number of adhesive WBC in the microcirculation of rats after burn (piece/100μm venule)

　　与对照组比较：^*P＜0.01，^**P＜0.05 健康人illask.com

表3　烧伤后3小时细动脉口径与流速的变化

　　Tab3　Diameter and blood velocity of the third artery 3h after burn 34yx.com

　　与对照组比较：^*P＜0.01

　　因此，我们认为在烧伤休克早期，内源性NO含量增加，对微循环具有一定的改善作用，它是机体的保护性反应，人为的不适当地抑制NO产生，可使微循环障碍加重，动物存活率降低。有关NO在烧伤休克中的确切作用及机制尚需进一步深入研究。 健康人illask.com

　　参考文献

　　1　Moncada S,Palmer PMJ,Higgs EA.Nitric oxide:physiology,pathophysiology and pharmacology.Pharm Rev,1991,43:109-142. illask.com

　　2　Statman R,Cheng W,Cunningham JN,et al.Nitric oxide inhibition in the treatment of the sepsis syndrome is detrimental to tissue oxygenation.J Surg Res,1994,57:93-98.

　　3 Becker WK,Shippee RL,Mcmanus At,et al.Kinetics of nitrogen oxide production following experimental thermal injury in rats.J Trauma,1993,34:855-862. 生死游戏34yx.com

　　4 吴坤莹，赵克森，朱佐江，等.腹腔透析可治疗大鼠烧伤休克.中国病理生理杂志，1987，3：88-91.

　　5　Gray SD.Rat spinotrapezius muscle preparation for microscopic observation of the terminal vascular bed.Microvas Res,1973,5:394-400. 健康热点healthhot.cn

　　6 Hegesh E, Shiloah J.Blood nitrates and infantile methemoglobinemia.Chinic Chimica Acta,1982,125:107-115.

　　7 Minnard EA,Shou J,Naama H,et al.Inhibition of nitric oxide synthesis is detrimental during endotoxemia.Arch Surg,1994,129:142-148. 34yx.com